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良好的實(shí)驗(yàn)動物給藥和采血(包括途徑和體積)規(guī)范指南
該文為歐盟制藥工業(yè)協(xié)會(EFPIA)和歐洲替代動物實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證中心(ECVAM)之間的初步研究結(jié)果。其目的在于為安全性評價(jià)實(shí)驗(yàn)室的研究者提供最新的易于使用的數(shù)據(jù)庫以幫助研究設(shè)計(jì)過程，同時(shí)最大可能地考慮到實(shí)驗(yàn)動物的福利。
盡管該文針對的是歐洲制藥工業(yè)界的研究者，但支撐該數(shù)據(jù)庫的基本原理及改進(jìn)建議同樣適用于所有在他們的研究中使用這些動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的人，不論是研究所、大學(xué)或其它行業(yè)中的研究者。
有關(guān)供試品給予和采血的出版物眾多，且許多實(shí)驗(yàn)室在多年的經(jīng)驗(yàn)和實(shí)踐基礎(chǔ)之上亦發(fā)展了它們自己的內(nèi)部指南。在歐盟化妝品標(biāo)準(zhǔn)86/609EEC中，我們有義務(wù)簡化實(shí)驗(yàn)以最小化動物的緊張程度。我們希望該文能夠?qū)δ切┴?fù)責(zé)方案設(shè)計(jì)和審核的研究者提供有用的背景數(shù)據(jù)。
該文基于歷年所有可能收集到的同行評議出版物，但我們未能夠收集到的內(nèi)部數(shù)據(jù)和那些工作組的經(jīng)驗(yàn)(以及行業(yè)提交的有用的注釋)除外。該指南亦強(qiáng)調(diào)了持續(xù)性簡化與給藥和采血有關(guān)的技術(shù)的必要性，并且建議該如何去進(jìn)行這方面的工作。應(yīng)該鼓勵(lì)實(shí)驗(yàn)室間的數(shù)據(jù)共享以避免重復(fù)性動物研究，以及共享在某些方法或其它情況下的“藥物過量”所引起的與動物福利有關(guān)的實(shí)際技術(shù)和科學(xué)問題。有必要對該指南中涉及到的“正常動物”要求進(jìn)行特殊考慮，如妊娠和哺乳期間的動物。當(dāng)給藥體積較大或過度采樣時(shí)對研究結(jié)果的詮釋可能會令人感到困惑，特別是使用麻醉動物時(shí)。
良好的給藥規(guī)范指南
引言
各種科學(xué)研究都需要對實(shí)驗(yàn)動物給藥以符合藥品注冊要求。特別是在制藥工業(yè)領(lǐng)域已研究了與動物福利以及科學(xué)性相一致的給藥水平。在新藥的臨床前安全性評價(jià)階段使用多種“有效劑量”以盡量確定必要的安全性范圍是一種常規(guī)慣例。在使用低毒或溶解性極差的化學(xué)藥品以一種可接受的制劑形式進(jìn)行研究時(shí)，動物的個(gè)體給藥體積可能較大以滿足科學(xué)性和注冊的要求。擬用臨床劑量可能會使得給藥體積較大，超過了動物可接受的正常給藥體積，如靜脈內(nèi)注射用的造影劑或血漿增容藥物。
EFPIA/ECVAM技術(shù)小組的目標(biāo)如下：
(i)提供一個(gè)藥品注冊當(dāng)局所要求的毒性研究中常規(guī)使用的實(shí)驗(yàn)動物的給藥體積的指南；
(ii)根據(jù)動物福利和實(shí)用性提供一個(gè)在良好規(guī)范條件下常規(guī)使用的一致性劑量水平；
(iii)提供一個(gè)代表常規(guī)規(guī)范上限的劑量水平，以為特殊研究留下一定的劑量擴(kuò)展余地。
表1表示最常使用的種屬的一般給藥途徑下的給藥體積。它們是根據(jù)發(fā)表的文獻(xiàn)和內(nèi)部指南綜合得到的結(jié)果。現(xiàn)在認(rèn)為絨猴和小型豬在此類常用動物之列，因?yàn)樗鼈冊跉W洲的使用日漸增加。
每一列顯示了兩組數(shù)據(jù)，左側(cè)數(shù)據(jù)擬用來指導(dǎo)在單次或多次給藥的“良好規(guī)范”中的給藥體積；所給出的右側(cè)數(shù)據(jù)為可能的最大給藥值。如果超過了最大值就會涉及到動物福利或科學(xué)性，應(yīng)當(dāng)參考負(fù)責(zé)獸醫(yī)的外科醫(yī)生的意見。在某些實(shí)際運(yùn)用，這些數(shù)據(jù)應(yīng)符合藥典要求。
從近來發(fā)表的文獻(xiàn)中已經(jīng)得到了這些建議的最大值中的某些數(shù)據(jù)，但當(dāng)與“良好規(guī)范”數(shù)據(jù)相比時(shí)顯得較高。強(qiáng)調(diào)了較高給藥體積時(shí)對動物福利和使用的原料制劑進(jìn)行仔細(xì)關(guān)注的必要性，特別是擬進(jìn)行重復(fù)給藥時(shí)。研究的持續(xù)時(shí)間和科學(xué)有效性應(yīng)該讓步于由于給藥體積過高所出現(xiàn)的生理反應(yīng)。因此在方案定稿以及著手研究之前通過比如監(jiān)察員或倫理委員會充分地考慮到了這些出版物中的倫理觀要素。亦就倫理及科學(xué)依據(jù)強(qiáng)烈要求對任何新劑型進(jìn)行物理化學(xué)相容性研究(體外)和小型的先導(dǎo)性研究(少量動物組)以免在大型研究中出現(xiàn)失誤。給藥體積應(yīng)該最大限度地與化合物劑型和給藥準(zhǔn)確性相一致。
給藥途徑
經(jīng)口給藥途徑：某些情況下在給藥前有必要限制動物的攝食。該因素可能會影響藥物吸收。較大的給藥體積(40ml/kg)表明超過了胃容量負(fù)荷并快速通過胃進(jìn)入小腸。較大的給藥體積亦可以造成食管返流。禁食時(shí)間取決于動物種屬的飼養(yǎng)方式、禁食的起始時(shí)間、種屬的生理學(xué)特征、給藥時(shí)間的長短、食物和光照周期。當(dāng)藥液通過灌胃給予時(shí)，要求給藥必須準(zhǔn)確以避免給藥意外。
胃腸外給藥途徑：對于經(jīng)胃腸外給予的藥物而言，應(yīng)考慮所采用的制劑的給藥體積、給藥前和給藥后制劑的穩(wěn)定性、pH、粘度、等滲性、緩沖能力、無菌及生物相容性因素。這對于多次給藥研究尤其重要。Claassen總結(jié)了這些因素中的某些細(xì)節(jié)。應(yīng)使用最小型號的針頭、考慮給藥體積、注射物粘度、注射速度和動物種屬。
皮下給藥：該途徑經(jīng)常使用。吸收的速度和程度取決于制劑。
腹腔內(nèi)給藥：多次給藥研究時(shí)較少用到該途徑，因?yàn)榭赡軙霈F(xiàn)并發(fā)癥。該途徑存在著注射入腸道的可能，而且刺激性物質(zhì)可能引起腹膜炎?；衔镆曰鞈乙盒问浇o予后在腹腔的吸收取決于藥物粒子及賦型劑的特征，藥物可能被吸收進(jìn)行全身或局部循環(huán)。
肌肉內(nèi)注射：肌肉內(nèi)注射可能會引起疼痛，因?yàn)樽⑸鋾r(shí)必須使肌纖維處于緊張狀態(tài)。必須對注射部位進(jìn)行選擇以盡量減少神經(jīng)損傷的可能性。多次給藥研究不應(yīng)在同一個(gè)部位反復(fù)注射。當(dāng)吸收速度很重要時(shí)，必須在水性和油性制劑之間加以選擇(油性制劑在注射部位的殘留很可能超過24小時(shí)。)。進(jìn)行多劑量研究時(shí)，有必要考慮到出現(xiàn)炎癥及其后遺癥。
靜脈內(nèi)給藥：對于該途徑，必須區(qū)分團(tuán)注、緩慢靜脈內(nèi)注射和靜脈內(nèi)輸液。表1中的數(shù)據(jù)與團(tuán)注和緩慢靜脈內(nèi)注射有關(guān)。
(i)團(tuán)注：在大多數(shù)采用靜脈內(nèi)給藥途徑的研究中，受試物在大約1 min內(nèi)快速給予。如此相對迅速的注射要求受試物與血液之間具有相容性且粘度不能太高。當(dāng)需要給予較大的體積時(shí)，注射原料必須加熱至與體溫相同。在靜脈內(nèi)給藥中注射速度是一個(gè)重要因素，建議對于嚙齒類動物而言，注射速度不應(yīng)超過3ml/min。犬經(jīng)靜脈內(nèi)快速注射6ml /kg生理鹽溶液后未發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞壓積或心率變化，但快速注射20ml /kg后血液被稀釋了15%且出現(xiàn)一過性心動過速(一分鐘內(nèi)心率增加達(dá)46%)。
(ii)緩慢靜脈內(nèi)注射：因?yàn)榛衔镱A(yù)期的臨床適應(yīng)癥或限制性因素如溶解性或刺激性，因此可能有必要考慮通過緩慢靜脈內(nèi)注射給藥。特別需加以說明的是緩慢靜脈內(nèi)注射會應(yīng)用不同的技巧以盡可能地避免原料被注射入血管外組織。對于注射過程為5–10min的緩慢靜脈內(nèi)注射而言，可能需要采用標(biāo)準(zhǔn)的或蝶形針，或淺靜脈內(nèi)注射(適用于短期靜脈內(nèi)注射)時(shí)使用靜脈內(nèi)套管并用膠帶固定更佳，或在使用前通過外科手術(shù)放置注射針(適用于更長時(shí)間的注射或多次注射)。
已有證據(jù)表明大鼠每日可以1ml/min的速度靜脈內(nèi)注射等滲鹽溶液劑量達(dá)80ml/kg，共4天，沒有明顯不適癥狀或肺部損傷。但是，當(dāng)注射時(shí)間增加至30天時(shí)，給藥速度為0.25、0.5或1.0ml/min的大鼠肺部損傷的發(fā)生率和嚴(yán)重程度均增加。在用藥早期可能出現(xiàn)不良反應(yīng)，但是在這么短的時(shí)間內(nèi)不會有病理變化出現(xiàn)。
(iii)連續(xù)輸液：出于溶解性或臨床適應(yīng)癥這一類似原因，有必要考慮連續(xù)輸液，如果長時(shí)間輸液則必須進(jìn)行周詳?shù)目紤]。給藥體積和速度取決于所給物質(zhì)并應(yīng)考慮液體治療規(guī)范。作為一個(gè)指南，單次給藥情況下的給藥體積占循環(huán)血容積的10%時(shí)，給藥時(shí)間應(yīng)不低于2小時(shí)。有關(guān)循環(huán)血容積的信息見表3。長時(shí)間輸液應(yīng)考慮如何盡量減少動物的不適，這是一個(gè)關(guān)鍵因素。
輸液的總持續(xù)時(shí)間亦是一個(gè)應(yīng)該考慮的因素。表2給出了推薦的間斷性(4小時(shí)/天)和持續(xù)性(24小時(shí))輸液的給藥速度和體積(需要進(jìn)一步的數(shù)據(jù)來完善此表)。
家兔的給藥體積和速度基于來源于胚胎毒性研究的數(shù)據(jù)，該研究表明對胎兒沒有影響，但當(dāng)給藥劑量>2 ml/kg/h時(shí)，母體出現(xiàn)血管周粒細(xì)胞成袖口狀聚集以及增殖性心內(nèi)膜炎。大鼠的典型輸液速度在1–4 ml/kg/ h，但在胚胎毒性研究中的理想速度應(yīng)不超過2ml/kg/h。對于小鼠、犬和恒河猴以及小型豬(未公開數(shù)據(jù))的數(shù)據(jù)基于為期1個(gè)月的重復(fù)給藥研究。
在四篇出版物中突出了其它表示高給藥體積時(shí)的賦型劑劑型的重要性的有限數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)表明對于靜脈內(nèi)輸液的可耐受體積方面存在著巨大差異，取決于所使用的賦型劑。尚未研究對其它生理系統(tǒng)的長期影響。
皮內(nèi)給藥：該部位給藥主要用于評估免疫、炎癥或過敏反應(yīng)。原料可以用佐劑配制。給藥體積為0.05–0.1 ml，取決于皮膚厚度。
用于給藥的賦型劑
在所有動物研究中，賦型劑的選擇均是一個(gè)重要的考慮因素。賦型劑本身應(yīng)該給藥物提供最佳的暴露量而不應(yīng)影響受試化合物的試驗(yàn)結(jié)果，由此一個(gè)理想的賦型劑應(yīng)該無生物活性，對化合物的生物物理特性沒有影響且對動物沒有毒性作用。如果賦型劑的成分之一具有生物學(xué)效應(yīng)，則應(yīng)該限制該賦型劑劑量，如此就能夠盡可能地減弱該賦型劑的這些效應(yīng)或不會產(chǎn)生效應(yīng)。給予化合物時(shí)所使用的簡單賦型劑包括等滲性水溶液、緩沖溶液、助溶系統(tǒng)、混懸液和油溶液。對于非水性注射液，再次給藥前應(yīng)考慮藥物的吸收時(shí)間。當(dāng)給予混懸液時(shí)，應(yīng)考慮原料的粘度、pH和等滲性。使用助溶劑系統(tǒng)必須小心，因?yàn)橘x型劑本身具有劑量限制性毒性。鼓勵(lì)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)開展的動物研究以及受試物特征來發(fā)展新的策略以促進(jìn)最佳賦型劑的選擇。
良好采血的規(guī)范指南
引言
采血為在實(shí)驗(yàn)動物中執(zhí)行的最常規(guī)程序之一，在BVA/FRAME/RSPCA/UFAW聯(lián)合工作組的第一次報(bào)告中總結(jié)了實(shí)驗(yàn)哺乳動物和禽類的采血方法。該當(dāng)前文章的目的在于根據(jù)可利用的最新信息提供一個(gè)易于使用的指南，并著重于毒代動力學(xué)以及毒理學(xué)(藥代動力學(xué))研究的需要。從各種嚙齒類動物的眶后靜脈叢采血的方法仍然被廣泛使用，因?yàn)椴捎迷摲椒〞霈F(xiàn)遺癥，因此描述了一種建議的替代途徑。
循環(huán)血容量
采血量根據(jù)準(zhǔn)確的循環(huán)血容量數(shù)據(jù)計(jì)算。文獻(xiàn)綜述表明應(yīng)考慮到這些數(shù)據(jù)的變異情況，可能與使用的技術(shù)、品系和動物性別等有關(guān)。引用最多的技術(shù)為同位素標(biāo)記性紅細(xì)胞、同位素標(biāo)記性轉(zhuǎn)鐵蛋白、同位素標(biāo)記性血清白蛋白、標(biāo)記用染料、酶稀釋法、光纖和右旋糖苷-70。
表3給出了在安全性評價(jià)研究中普遍使用的動物種屬的循環(huán)血容量。此處總結(jié)了在毒理學(xué)研究中使用得日漸頻繁的絨猴和小型豬的數(shù)據(jù)。顯示的數(shù)據(jù)根據(jù)不同來源并假定動物為成熟、健康并且營養(yǎng)充足的數(shù)據(jù)綜合而成。
采血體積
我們推薦的數(shù)據(jù)基于公開的研究結(jié)果，最近開展的研究以告知工作組有關(guān)某些問題的數(shù)據(jù)和正在被提交以供公開的數(shù)據(jù)以及來源于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)操作程序的信息。
當(dāng)采血量接近極限時(shí)動物福利為首要考慮的問題，但亦必須考慮動物的生理反應(yīng)與科學(xué)性之間的沖突，因?yàn)檫@可能影響數(shù)據(jù)的闡釋和有效性。在可疑的情況下，監(jiān)察員或獸醫(yī)應(yīng)在采血前對動物表現(xiàn)出來的臨床癥狀進(jìn)行評估。
Scipioni等的工作表明24小時(shí)內(nèi)大鼠的取血量達(dá)其總血容量的40%并重復(fù)取血2周后總體上不會引起致病性效應(yīng)?；旧现挥猩倭坑嘘P(guān)取血后動物健康的臨界特征的數(shù)據(jù)，如心率、呼吸特征、各種激素水平以及行為特征如活動和移動自身所花的時(shí)間。所有這些均可能由于過度取血而出現(xiàn)變化，但研究這些變化需要耗費(fèi)相當(dāng)多的精力和資源。然而，血液學(xué)指標(biāo)很易通過一個(gè)小型的研究來測定，采集不同體積的血量后，測定了動物的紅細(xì)胞數(shù)量(RBC)、血紅蛋白水平(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞容量(MCV)和紅細(xì)胞分布寬度(RDW)。在24小時(shí)內(nèi)的取血體積占體重大約為250g的雄性和雌性SD大鼠(n=7)的循環(huán)血容量的7.5%、10%、15%和20%(按0.3-ml等分)以模擬動力學(xué)研究。隨后對動物進(jìn)行追蹤觀察，總共29天。
結(jié)果表明所有這些指標(biāo)恢復(fù)到基線水平所花的時(shí)間存在相當(dāng)大的差異，其中取血時(shí)間占循環(huán)血容量的15%和20%的動物組中的某些指標(biāo)(MCV, RDW)在29天后未能恢復(fù)到基線水平。此處推薦的針對多次采血的恢復(fù)時(shí)間是指所有采血組中的大鼠恢復(fù)到正常水平(每只大鼠的初始水平加減10%)所耗的時(shí)間。推薦單次采血(如常規(guī)毒性研究要求如此)的體積不應(yīng)超過循環(huán)血容量的15%，因?yàn)槿绻裳^快可能引起失血性休克。多次少量采血不大可能產(chǎn)生類似的急性效應(yīng)。
表4反映了極限體積和足夠的恢復(fù)期并且考慮了多次采血后的應(yīng)激性，整體嚴(yán)重性評估中的其它過程除外。該表著重于單次和多次采血體系。建議對毒性研究動物給予額外的恢復(fù)時(shí)間，因?yàn)樵诖祟愌芯恐斜仨殗?yán)格評價(jià)血液學(xué)指標(biāo)。
計(jì)劃采用較高的體積(占循環(huán)血容量的20%)以利于毒代或藥代動力學(xué)的連續(xù)性采血，此處通常要求多次、少量取樣。但是，應(yīng)該記住如此大體積采血對血液動力學(xué)的重大影響，可能影響半衰期的計(jì)算。如果最后一次采樣在處死動物的24小時(shí)內(nèi)則有可能對終末半衰期進(jìn)行評估。這些數(shù)據(jù)不包括最后一個(gè)樣本，該樣本為當(dāng)動物最終被麻醉時(shí)能夠被采集的一個(gè)樣本。未考慮使用血液代用品，因?yàn)樵谕扑]的采血體積下不允許使用此類人為干預(yù)。
采用表4中的數(shù)據(jù)得到不會明顯干擾動物正常生理的采血體積的簡易參考指南，見表5。
采血部位
靜脈穿刺和靜脈切開的部位主要考慮用于嚙齒類動物和家兔。根據(jù)采血程序的技術(shù)進(jìn)展對該信息進(jìn)行了總結(jié)；每種種屬的采血部位的優(yōu)勢和缺點(diǎn)見表6，重復(fù)采樣的推薦部位總結(jié)于表7。
值得注意的是從不同部位采集的樣品在臨床病理數(shù)據(jù)方面可能有所不同，且對歷史數(shù)據(jù)庫有影響。對于更加傳統(tǒng)的采血途徑，可從標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)中找到方法學(xué)描述。但是，對需要特別提及的其它方法綜述如下。
跗外側(cè)靜脈(隱靜脈)：該技術(shù)已經(jīng)在許多實(shí)驗(yàn)動物中應(yīng)用，包括大鼠、小鼠、倉鼠、沙鼠、豚鼠、雪貂、水貂以及體型較大的動物，可以采集占循環(huán)血容量5%的血量。該方法不要求麻醉，因此特別適用于重復(fù)采血，如藥代動力學(xué)研究。隱靜脈在跗骨關(guān)節(jié)的旁邊，當(dāng)刮去被毛并用酒精擦拭后很容易看見。將動物置于合適的固定器上，比如塑料試管，操作者分開動物的后肢。在關(guān)節(jié)上輕輕施壓則該靜脈凸起，然后采用能夠滿足快速取血而不會引起溶血的最小號的針頭刺入血管(如25–27G針頭適用于大鼠和小鼠)。對少量采血而言，可以采用簡單的刺傷從而在刺傷部位快速形成血滴，此時(shí)可使用微量血細(xì)胞比容試管收集標(biāo)準(zhǔn)體積的血液。采血后，在刺傷部位施加足夠的壓力以止血。剝?nèi)ソY(jié)痂可連續(xù)取血。
除頑固性(很少)出血外，目前看來沒有并發(fā)癥報(bào)道，該方法的優(yōu)勢在于不需麻醉。即使沒有根據(jù)體重增長、晝夜活動規(guī)律、行為等進(jìn)行過有關(guān)動物福利的研究，但看來該途徑不大可能嚴(yán)重影響動物的健康。
耳緣靜脈/耳中央動脈：從耳緣靜脈采血最常用于家兔和豚鼠。該途徑也可在小型豬中選用，通常與靜脈內(nèi)套管結(jié)合使用。必須進(jìn)行良好的固定，在采血前大約20–30分鐘應(yīng)用局麻膏劑有助于防止針頭穿透皮膚時(shí)動物頭部出現(xiàn)搖擺。也可用凡士林涂在靜脈的表面，然后刺破靜脈用試管收集血液。如果取血量較大，則可通過家兔耳中央動脈取血，但取后必須按壓至少2分鐘以止血和防止血腫。持續(xù)性放血5和10分鐘后應(yīng)對動物進(jìn)行檢查。使用留置套管能夠重復(fù)從該動脈采血，因此有利于超過8小時(shí)的動力學(xué)研究。
舌下靜脈：該操作在嚙齒類動物如大鼠中易于進(jìn)行且適合于較大體積(如0.2–1 ml)的頻繁性采血，僅受限于采血體積和必要的重復(fù)性麻醉。一種簡化的方法避免了以前的方法中所見到的缺點(diǎn)且能夠用于重復(fù)性采血。大鼠麻醉后，由助手握持住大鼠，使其處于仰臥位。聚攏頸背部松弛皮膚以便部分阻塞靜脈血從頭部回流。第二名操作者用頂端被棉花包裹的涂抹棒輕輕拉出舌頭，用拇指和食指抓住舌頭，用23–25G皮下注射針頭刺破舌下靜脈之一(中線的左右側(cè)各有一根舌下靜脈)，盡可能靠近舌尖。將大鼠翻轉(zhuǎn)以便于血液流入試管中，采集到需要量的血后，松開施加在后頸部的壓力，將動物置于仰臥位。再次將舌頭拉出用頂端被干棉花包裹的涂抹棒止血；通常沒有必要使用任何抗凝劑。
采用該技術(shù)，大鼠在攝食和飲水或體重增長方面與未采血的麻醉對照動物相比沒有明顯差異。此外，該法較眼球后采血所引起的病理變化更少。但是，麻醉可能仍然是一個(gè)限制性因素。
尾側(cè)靜脈：原則上該途徑與跗外側(cè)靜脈相似，但傾向于獲得較小的采血量(小鼠0.1–0.15 ml；處于暖和條件下的大鼠最高可達(dá)2ml)?？梢酝ㄟ^注射器/針頭或刺穿尾側(cè)靜脈采血。由于勿需麻醉，這使得該途徑特別適用于重復(fù)采血。有必要使血管擴(kuò)張以促進(jìn)血流，可以將動物暴露于37°C的溫度中共5–8 min或加熱尾部。該方法損傷很小，基本不會影響動物健康，但在加熱時(shí)必須嚴(yán)密監(jiān)測動物的不適癥狀。
顱大靜脈：小型豬可以用繩套固定或?qū)⑵淝爸罂s固定于其背部。農(nóng)業(yè)上有時(shí)采用的其它方法(捆綁嘴部、捆綁豬軀干、通過后肢懸吊)會引起動物緊張，因此不適用于實(shí)驗(yàn)動物，因?yàn)闀ρ芯康目茖W(xué)性產(chǎn)生潛在的不利影響。為避免損傷迷走神經(jīng)，應(yīng)將針頭插入頸部右側(cè)，胸骨柄旁，以30–45°角向左肩方向進(jìn)針。當(dāng)針頭進(jìn)入血管的時(shí)候通過取樣器可以覺察到破裂的感覺，然后可以輕易地采集到血樣。該方法亦被用來作連續(xù)性靜脈穿刺，但抽出針頭后穿刺部位形成血腫，因此在不要求每周頻繁采血的情況下，該方法為一種最佳候選程序。
尾尖切斷術(shù)(斷尾法):該技術(shù)通常用于大鼠和小鼠，采血量為0.1–0.2ml。切斷術(shù)應(yīng)僅限于尾尖(每次0.5–1mm應(yīng)當(dāng)足夠，隨試驗(yàn)需要最多只能切除5mm)，通過去除血凝塊可在短期內(nèi)重復(fù)采血。可明顯縮短尾部(如＞5mm)的連續(xù)性切斷術(shù)不能被接受。該技術(shù)不適合老齡動物。建議對動物進(jìn)行麻醉。
心臟穿刺：該方法通常在麻醉?xiàng)l件下進(jìn)行，在過去由于缺乏替代途徑，因此被用于對小型嚙齒類動物采血。但是，現(xiàn)在有其它方法可供利用，并且由于潛在性疼痛和致命性后遺癥，如心包出血以及心臟壓塞，因此該技術(shù)應(yīng)僅用于末期采血。
眼球后靜脈叢：研究者過去普遍采用眼球后采血途徑，但會引起的不良反應(yīng)。因?yàn)檫@些不良反應(yīng)及其潛在的嚴(yán)重性，因此該方法所涉及到的利害關(guān)系正日漸突出。但是，最近已開發(fā)出其它符合科學(xué)性要求的方法，由此改善了動物福利。然而，技術(shù)小組感到在新方法的上下文中應(yīng)詳細(xì)回顧眼球后采血的優(yōu)勢和缺點(diǎn)。
對于所有種屬的靜脈叢采血均應(yīng)該在常規(guī)麻醉?xiàng)l件下進(jìn)行，在某些國際注冊中要求對動物進(jìn)行麻醉。大量工作者對該方法均進(jìn)行了詳盡的描述。
僅有少量有關(guān)簡化該方法的研究工作被公開。作為穿透結(jié)膜的最佳方法以盡量減輕組織損傷的途徑(從腹側(cè)、背側(cè)和上方進(jìn)入大鼠眼球)已有所討論。在同一部位的兩次采血之間必須有2周間隔期以使損傷組織可以在大多數(shù)情況下恢復(fù)，但這并不意味著動物在完全恢復(fù)前的早期不會經(jīng)歷某些不適。然而某些研究已表明重復(fù)眼窩采血不會長期影響動物的晝夜節(jié)律或眼窩組織結(jié)構(gòu)(如這兩篇文獻(xiàn)中的研究均表明任何組織損傷均痊愈)，其它研究發(fā)現(xiàn)了組織變化、異常臨床表現(xiàn)和明顯不適，從而出現(xiàn)人道立場不得不處死動物從而給研究工作帶來損失。該方法還存在其它嚴(yán)重的潛在性不良反應(yīng)：
(i)引起血腫和眼壓過高的眼球后出血，必定會使動物感到疼痛；
(ii)任何為止血而施加的壓力(如壓迫眼部)或來源于血腫的壓力均能導(dǎo)致角膜潰瘍、角膜炎、角膜翳形成、眼球破裂和小眼畸形；
(iii)視神經(jīng)和其它眼窩內(nèi)結(jié)構(gòu)損傷可導(dǎo)致視力降低甚至失明；
(iv)毛細(xì)管引起眼眶脆骨骨折和神經(jīng)損傷；伴玻璃體液丟失的眼球自身穿通傷。
許多這些位于眼窩深處的有害后遺癥可能仍然未被發(fā)現(xiàn)。有害副作用的發(fā)生率差異似乎介于1%和2%之間，但出于所采用的技術(shù)不同，該發(fā)生率可能遠(yuǎn)高于此，即使是經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)操作人員(見參考文獻(xiàn)55中的表1)。
穿刺頻率
盡量減少穿刺次數(shù)從而取得良好的科學(xué)性數(shù)據(jù)這一點(diǎn)非常重要。不應(yīng)使用同一穿刺部位，如沿著靜脈采用不同的穿刺點(diǎn)。
套管
對于重復(fù)取血而言這是一項(xiàng)非常重要的技術(shù)。在短期(工作日)采血中可使用臨時(shí)性套管如蝶形針和套管針，然而對于長期取血而言，有必要通過外科手術(shù)植入生物排斥性套管。這些方法允許重復(fù)采血，且盡量減輕了動物的痛苦和不適。也可利用皮下靜脈輸液港的作用，植入該裝置的動物可與其同類呆在一起，但應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，該方法存在如下大量潛在性問題：
(i)外科手術(shù)技巧為基本要求，必須在無菌條件下進(jìn)行以使動物長期性保持良好的狀態(tài)及避免并發(fā)癥如感染。血凝塊頻繁出現(xiàn)并可能影響采血和延長藥物的輸液時(shí)間；
(ii)可能有必要固定動物或單獨(dú)飼養(yǎng)以防止套管脫落或引起刺痛，這就是在長期采血中首選套管法的原因；
(iii)長期植入套管后，可出現(xiàn)血管滲透且動物亦可能因此沿植入的套管而長出自身的套管。
麻醉
在BVA/FRAME/RSPCA/UFAW的首次報(bào)告中給出了某些關(guān)于不同的麻醉對脾被膜(有該組織存在的情況下)肌細(xì)胞的影響程度的評論以及其它有助于采血的方法。對于小型實(shí)驗(yàn)室哺乳動物的采血，值得注意的是聯(lián)用芬太尼和氟阿尼酮(麻醉藥Hypnorm)加或不加咪達(dá)唑倫(鎮(zhèn)靜藥Hypnovel)在所有種屬中均明顯引起外周血管擴(kuò)張。盡管這有利于采血，但亦更容易出現(xiàn)采血后血腫，因此應(yīng)特別注意止血。應(yīng)考慮使用局麻藥。
結(jié)論和建議
對所有動物種屬的采血現(xiàn)在均有一定的替代性方法，特別是較小的嚙齒類動物，而在過去不易做到。此外，某些方法需要麻醉或有害副作用的發(fā)生率較高，可能嚴(yán)重影響動物的福利，特別是要求重復(fù)取血時(shí)。因此我們提出如下建議：
(i)推薦的對所有嚙齒類動物采血的途徑為尾側(cè)靜脈、舌下靜脈和跗外側(cè)靜脈，家兔采用耳緣靜脈、耳中央動脈和頸靜脈；
(ii)眼球后采血并恢復(fù)僅適用于無法采用其它途徑時(shí)；
(iii)心臟采血僅作為終末處死動物時(shí)在麻醉?xiàng)l件下進(jìn)行。
最后，我們想強(qiáng)調(diào)的是在所有與動物有關(guān)的實(shí)驗(yàn)過程中，加強(qiáng)培訓(xùn)和人員的能力對于成功采血、最小化組織損傷以及對于動物的健康和福利是至關(guān)重要的。
參考文獻(xiàn)
表1 符合良好規(guī)范的給藥體積(以及可能的最大給藥體積)a
|
種屬
|
給藥途徑和體積(ml/kg-1)
|
|||||
|
經(jīng)口
|
皮下
|
腹腔
|
肌肉
|
靜脈內(nèi)(團(tuán)注)
|
靜脈內(nèi)(緩慢注射)
|
|
|
小鼠
|
10(50)
|
10(40)
|
20(80)
|
0.05b (0.1)b
|
5
|
(25)
|
|
大鼠
|
10(40)
|
5(10)
|
10(20)
|
0.1b(0.2)b
|
5
|
(20)
|
|
家兔
|
10(15)
|
1(2)
|
5(20)
|
0.25(0.5)
|
2
|
(10)
|
|
犬
|
5(15)
|
1(2)
|
1(20)
|
0.25(0.5)
|
2.5
|
(5)
|
|
短尾猴
|
5(15)
|
2(5)
|
c(10)
|
0.25(0.5)
|
2
|
c
|
|
絨猴
|
10(15)
|
2(5)
|
c(20)
|
0.25(0.5)
|
2.5
|
(10)
|
|
小型豬
|
10(15)
|
1(2)
|
1(20)
|
0.25(0.5)
|
2.5
|
(5)
|
a：對于非水性注射液，在再次給藥前應(yīng)考慮吸收時(shí)間。每日所使用的肌肉注射部位應(yīng)不超過兩個(gè)。皮下注射部位不包括給予弗氏佐劑。
b：每個(gè)部位的注射體積以毫升表示。
C：無可用數(shù)據(jù)。
表2. 重復(fù)靜脈內(nèi)輸液: 給藥體積/速度(以及可能的最大給藥體積/速度)a
|
每日輸液時(shí)間
|
小鼠
|
大鼠
|
家兔b
|
犬
|
短尾猴
|
小型豬
|
|
每日總體積(ml/kg)
|
||||||
|
4小時(shí)
|
Lc
|
20
|
Lc
|
20
|
Lc
|
Lc
|
|
24小時(shí)
|
96(192)
|
60(96)
|
24(72)
|
24(96)
|
60
|
24
|
|
速度(ml/kg/h)
|
||||||
|
4小時(shí)
|
Lc
|
5
|
Lc
|
5
|
Lc
|
Lc
|
|
24小時(shí)
|
4(8)
|
2.5(4)
|
1(3)
|
1(4)
|
2.5
|
1
|
a：非水性注射液見正文。某些情況下顯示了兩套數(shù)據(jù)。括號內(nèi)的數(shù)據(jù)為可能的最大值。
b：基于致畸性研究。
c：無可用數(shù)據(jù)。
表3 實(shí)驗(yàn)動物的循環(huán)血容量
|
種屬
|
血容量(ml/kg)
|
|
|
推薦的平均值a
|
平均值范圍
|
|
|
小鼠
|
72
|
63-80
|
|
大鼠
|
64
|
58-70
|
|
家兔
|
56
|
44-70
|
|
犬(Beagle)
|
85
|
79-90
|
|
短尾猴(恒河猴)
|
56
|
44-67
|
|
短尾猴(獼猴)
|
65
|
55-75
|
|
絨猴
|
70
|
58-82
|
|
小型豬
|
65
|
61-68
|
a：推薦的平均值相當(dāng)于平均值范圍中的中間值。
表4 體積限度和恢復(fù)期
|
單次采血(如毒性研究)
|
多次采血(如毒性研究)
|
||
|
采血量占循環(huán)血容量
百分比(%)
|
大致恢復(fù)期
|
24小時(shí)內(nèi)采血量占
循環(huán)血容量百分比(%)
|
大致恢復(fù)期
|
|
7.5%
|
1周
|
7.5%
|
1周
|
|
10%
|
2周
|
10–15%
|
2周
|
|
15%
|
4周
|
20%
|
3周
|
表5 指定體重種屬的總血容量和推薦的最大采血量
|
種屬(體重)
|
血容量(ml)
|
7.5%(ml)
|
10%(ml)
|
15%(ml)
|
20%(ml)
|
|
小鼠(25g)
|
1.8
|
0.1
|
0.2
|
0.3
|
0.4
|
|
大鼠(250g)
|
16
|
1.2
|
1.6
|
2.4
|
3.2
|
|
家兔(4kg)
|
224
|
17
|
22
|
34
|
45
|
|
犬(10kg)
|
850
|
64
|
85
|
127
|
170
|
|
短尾猴(恒河猴)(5kg)
|
280
|
21
|
28
|
42
|
56
|
|
短尾猴(獼猴)(5kg)
|
325
|
24
|
32
|
49
|
65
|
|
絨猴(350g)
|
25
|
2.0
|
2.5
|
3.5
|
5
|
|
小型豬(15kg)
|
975
|
73
|
98
|
146
|
195
|
表6 不同采血方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)總結(jié)
|
采血途徑
|
普通麻醉
|
組織損傷a
|
重復(fù)采血
|
體積
|
種屬
|
|
頸靜脈
|
否
|
低
|
是
|
+++
|
大鼠、犬、家兔
|
|
頭靜脈
|
否
|
低
|
是
|
+++
|
短尾猴、犬
|
|
隱靜脈/跗外側(cè)靜脈
|
否
|
低
|
是
|
++(+)
|
小鼠/大鼠、絨猴/短尾猴、犬
|
|
耳緣靜脈
|
否(局麻)
|
低
|
是
|
+++
|
家兔、小型豬
|
|
股靜脈
|
否
|
低
|
是
|
+++
|
絨猴/短尾猴
|
|
舌下靜脈
|
是
|
低
|
是
|
+++
|
大鼠
|
|
尾側(cè)靜脈
|
否
|
低
|
是
|
++(+)
|
大鼠、小鼠/絨猴
|
|
耳中央動脈
|
否(局麻)
|
低
|
是
|
+++
|
家兔
|
|
顱大靜脈
|
否
|
低
|
是
|
+++
|
小型豬
|
|
尾尖切斷術(shù)(1–3mm)
|
是
|
中度
|
受限
|
+
|
小鼠/大鼠
|
|
眼球后靜脈叢
|
是
|
中度/高
|
是
|
+++
|
小鼠/大鼠
|
|
心臟b
|
是
|
中度
|
否
|
+++
|
小鼠/大鼠/家兔
|
a：組織損傷的可能性基于其可能的發(fā)生率以及任何后遺癥的嚴(yán)重程度，如炎癥反應(yīng)或組織學(xué)損傷
b：僅在最終處死動物時(shí)于麻醉?xiàng)l件下進(jìn)行。
表7 推薦的重復(fù)采血部位
|
種屬
|
推薦部位
|
|
小鼠
|
隱靜脈、尾側(cè)靜脈
|
|
大鼠
|
隱靜脈、尾側(cè)靜脈、舌下靜脈
|
|
家兔
|
耳緣靜脈、耳中央動脈、頸靜脈
|
|
犬
|
頭靜脈、頸靜脈、隱靜脈
|
|
短尾猴
|
頭靜脈、隱靜脈、股靜脈
|
|
絨猴
|
股靜脈、隱靜脈
|
|
小型豬
|
顱大靜脈
|
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